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    公开号:WO1992016650A1
    申请号:PCT/JP1992/000278
    申请日:1992-03-09
    公开日:1992-10-01
    发明作者:Hitoshi Kondou；Kazuhiko Nagata；Kazue Kawahara
    申请人:Unitika Ltd.；
    IPC主号:G01N33-00
    专利说明:
    [0001] 明 細 書
    [0002] マグネシウムィオン測定用試薬
    [0003] . (技術分野）
    [0004] 本発明は、 医学、 食品分析及び環境保全に有用な各種試料中のマ グネシゥムイオンを定量するマグネシウムイオン測定用試薬に関す るものである。
    [0005] (背景技術）
    [0006] 血液などの生体液中、 食品中、 及び河川などの環境中のマグネシ ゥムィオンの測定は、 日常的に広く測定されている重要なものであ る。 これらマグネシウムイオンの測定法は、 原子吸光法に代表され る機器分析法による定量法と、 キシリジルブルー法などの化学的手 法による定量法に大別される。 前者の定量法では比較的正確な結果 が得られる反面、 特別に高価な機器を必要と し、 操作も繁雜で熟練 を要する。 また、 後者の定量法は、 簡便な方法ではあるが、 マグネ シゥムィオンに対する特異性に欠けるため、 共存する物質の影響が 避けられずに、 大きな誤差要因を含んだ結果しか得られないという 問題点があった。
    [0007] これらを解決するために、 近年、 酵素反応を利用した種々のマグ ネ.シゥムイオン測定用試薬が提案されている。 これはへキソキナー ゼ （以下、 HKと略称する。 ） などの種々のキナーゼ類酵素がマグ ネシゥムイオンとアデノシン 5 '—三リ ン酸 （以下、 A T Pと略称 する。 ) との鐯体を基質としてその活性を癸現することを利用した ものである。 例えば、 HKとグルコース一 6—リン酸脱水素酵素 （以 下、 G 6 PDHと略称する。 ） との共役反応を利用した試薬 [メソッ ズ · ォブ .ェンザイマティ ック *アナリシス （Methods of E nzym atic Analysis) 第 3版、 592~59 7頁、 1 9 8 5年； U S P 4 , 657 , 8 54号公報] 、 H Kと類似した酵素である力 s、 グルコ ースに特異性の高いダルコキナーゼ （以下、 GlcKと略称する。 ） と G 6 PDHとの共役反応を利用した試薬 （第 25回日本臨床化学 会年会要旨集、 75頁、 1 985年； US P 4 , 778 , 754号公 報） 、 グリセロールキナーゼ （以下、 GlyKと略称する。 ） 、 グリ セロール一 3—リン酸脱水素酵素 （以下、 G 3 PDHと略称する。 ） 、 及びパーォキシダーゼ （以下、 P ODと略称する。 ） の 3つの酵 素の共役反応を利用した試薬 [ク リニカル · ケミ ス ト リー （C lini cal Chemistry) 3 2巻、 6 2 9〜 6 3 2頁、 1 9 8 6年] などが ある。 また、 WO 8 8Z0 8 1 3 7には、 マグネシウムイオンに対 して敏感なアデ二レー トキナーゼ又はへキソキナーゼの使用が可能 である旨の記載もあるが、 具体的な測定に関する開示は見当らない。 これらの酵素反応を利用した測定用組成物は化学的方法の簡便さ と測定の正確性を備えたものであつたが、 AT Pがマグネシゥムィ オン以外にも、 マンガン、 カルシウム、 亜鉛などの 2価の金属ィォ ンと錯体を形成し、 それらもまた酵素の基質になり得るものである ため、 これら金属イオンが試料中に多量に共存すると、 マグネシゥ ムィォンの定量に誤差を生ずる危険性も含んでいた。
    [0008] これに対し、 マグネシウムィォン以外の 2価金属ィオンをキレー ト剤によってマスキングすることにより、 これら測定誤差要因を回 避することも提案されている （特開平 1 一 5 1 1 0 0号公報参照） 。 前記、 各種の酵素的測定法のうち、 GlcKと G 6 P DHの共役反 応を利用する方法が、 試薬の安定性、 測定の正確性などの点で最も 実用的である。 しかしながら、 この方法でも、 測定の範囲が比較的 狭く、 広範囲にわたる種々の試料を用いた場合、 特に高浚度にマグ ネシゥムイオンを含む試料では、 測定毎に試料を希釈する操作が必 要となり、 測定の繁雜さが増すことがあった。 このため、 尿などの 高漉度にマグネシウムイオンを含む試料では、 この繁雑さが測定誤 差をまねく原因となっていた。
    [0009] (癸明の開示）
    [0010] 本凳明は、 上記の如く高澳度のマグネシゥムィォンを含む試料で も希釈せずに定量できる測定範囲を有するマグネシゥムィォン測定 用試薬を提供することを目的とするものである。
    [0011] 本発明者らは、 このような要求を満足するマグネシウムイオン測 定用組成物を提供することを目的として種々検討した結果、 G lc K と してザィモモナス （ Z ymomonas) 属細菌由来の G lcKを用いるこ とにより上記の目的を達成し、 本発明によるマグネシウムイオン測 定用組成物が日常的に使用するのに充分な性能を有する測定用耝成 物であることを見い出し、 本発明を完成するに到った。
    [0012] すなわち、 本発明は、 マグネシウムイオンを AT Pと鍺体を形成 ざせ、 この錯体を酵素反応の基質と して利用して定量するマグネシ ゥムィオン測定用試薬において、 ザィモモナス属細菌由来の GlcK を用いたマグネシゥムィ オン測定用試薬を要旨とするものである。 本発明のマグネシゥムィ オン測定用試薬は上記 GlcKや G 6 PD H以外に、 ATP、 ニコチンアミ ドアデニンジヌク レオチ ドリ ン酸 (以下、 N AD Pと略称する。 ） 、 グルコースを主成分と し、 その 他に通常キレー ト剤、 促進剤、 賦型剤、 防腐剤などの添加物なるも のを含ませることができる。
    [0013] 本発明の試薬における主成分の濃度と しては一般に GlcKが 0. 1 - 5 0ュニッ ト Zni G 6 PDHが 0.1 ~5 0ュニッ ト/ ml、 A T Pが 0.0 1 ~ 2 0 mM、 N A D Pが 0.1 ~ 2 0 mM、 グルコ一 スが 1〜 1 0 OraMとなるように使用すればよ く、 GlcKが 0.1 ~ 1 0ュニッ ト ml、 G 6 PDHが 0.2〜 1 0ュニッ ト Zml AT P力；0.05〜 1 0mM、 NAD Pが 0.2~ 1 0mM、 グルコースが 1 ~ 5 OmMとなるように使用することが望ましい。 キレート剤と しては、 0.0 0 1〜 1 OmM程度が好ましい。 塩類と しては、 ：！〜 3.0 OmM程度が好ましい。
    [0014] 本発明において用いられる GlcKと しては、 ザィモモナス属細菌 由来のものであることが必要である。 GlcKの起源と してはザィモ モナス属細菌であれば特に限定されるものではないが、 例えばザィ モモナス * モビリ ス （Z ymomonas mobilis) ゃザィモモナス · アナ エロビア ( Z ymomonas anaerobia) などを挙げること力 Sできる。 中 でも、 ザィモモナス · モビリ スに属する細菌からの GlcKが好まし い。 具体的にはザィモモナス ♦モビリス ATC C 3 1 82 1株、 3 1 823株、 35 0 0 0株、 350 0 1株、 1 0 9 8 8株、 29 1 9 1株、 29 1 29株などを挙げることができる。
    [0015] 上記のようなザィモモナス属細菌から GlcKを得るには、 微生物 を通常培養するときに用いる培地を用いて培養し、 得られた菌体か ら通常用いられている分離 ·精製方法により行うことができる。 本発明では GlcK以外に共役酵素と して G 6 PDHも用いる力、 G 6 PDHは酵母由来などの微生物や動物などその給源が特に限定 されるものではない。 好ましくは補酵素と して NAD Pだけでなく、 ニコチンァミ ドアデニンジヌク レオチ ド （以下、 NADと略称する。 ：) にも作用する G 6 P D H [例えば、 ロイ コノ ス ト ッ ク · メセンテ ロイァス L euconostoc mesenteroidesジ どのロイ コノス トック (Leuconostoc) 属、 シユー ドモナス * フノレォレツセンス (Pseud omonas fluorescensジ 7よどのシユー 卜モナス ^ P seudomonas) 属、 ザィモモナス ' モビリ ス （Z ymomonas mobilis) などのザィモモナ ス （Zymomonas) 属に属する微生物由来のものなど] が挙げられる。 さらに好ましくは、 NAD P、 NADともに補酵素と して使用でき、 かつ、 安定性、 保存性に富む好熱性細菌由来の G 6 P DHが望まし キレー ト剤と しては対数値で表したキレ一 ト安定度定数 （理化学 辞典、 第 3版増補版、 第 6 1頁、 1 9 8 1年、 岩波書店発行、 化学 大辞典、 第 1巻、 第 4 9 6〜4 97頁、 1 9 63年、 共立出版発行 参照） がマグネシウムとその他の 2価金属イオンの場合とで、 その 差が 2以上有するものであればよく、 具体例には、 エチレンジアミ ン四齚酸、 グリコールエーテルジァミ ン— N，Ν ,Ν'，Ν'—四齚酸 (以下 GEDTAと略称する） 、 1 ,2—ビス （0—アミ ノ フエノ キシ） エタンー Ν,Ν,Ν' ,Ν—四酢酸 （以下 B A Ρ Τ Αと略称する） 、 トランス一 1 ,2—シクロへキサンジアミ ン一 Ν,Ν,Ν',Ν，一四 醉酸、 ジヒ ドロキシェチルグリ シン、 エチレンジァミ ン一 Ν,Ν，一 二プロピオン酸、 ヒ ドロキシェチルイ ミ ノ二酢酸、 二 ト リ 口三酢酸 などが挙げられる。
    [0016] 塩類としては、 塩化力リゥムなど通常の塩類を支障なく使用でき る。
    [0017] 本発明の測定原理は、 マグネシゥムィオンを直接定量するもので はなく、 いったん ΑΤΡと鐯体を形成し、 その錯体を基質とする酵 素反応を利用するものであり、 具体的には以下の如く示すことがで きる。
    [0018] GlcK
    [0019] グルコース + AT P—マグネシウムイオン > グルコース一 6—リ ン酸 +AD P—マグネシウムイオン （ 1 )
    [0020] G 6 P D H
    [0021] グルコース一 6— リ ン酸 + NAD (P) + >
    [0022] 6—ホスホグルコン酸 + NAD (P) H + H+ (2)
    [0023] すなわち、 上記反応式 1、 2の共役反応で生成する NAD (P) Hの 34 Οηιηにおける吸収の増加速度を測定するものである。 本発明の測定用試薬を用いて試料中のマグネシゥ厶イオンを測定 するには、 例えばセル室が保温された分光光度計のセルに測定用試 薬を入れ、 測定温度 （2 0〜4 5。Cの間の任意の温度） に約 3分間 保温し、 その後、 試料を添加混和した後、 34 Οηπιの吸光度の上昇 を測定すればよい。 また試料を添加した後の測定の反応時間と して は 30秒〜 30分間の間で任意に選択することができるが、 自動分 析装置の場合にはその装置の測定条件に適応する条件を設定すれば よい。
    [0024] (発明を実施するための最良の形態）
    [0025] 次に、 本発明を実施例によって具体的に説明する。 実施例 1、 比較例 1
    [0026] GlcK及び G 6 P D Hは、 Zymomonas mobilis AT C C 29 1 9 iをザ ·バイオケミ カル · ジャーナル （The B iochemical J ou rnal) 228巻、 627~634頁、 1 9 8 5年に記載の方法に従つ て培養し、 それぞれ単離精製した。 すなわち、 1 5 %のグルコース、 0.5 %の酵母エキス、 0.05 %のリ ン酸一カ リ ウム、 0.05% の硫酸マグネシウムを含む溶液 1 リ ツ トルに 1 mgのピオチン、 2 rag のパン トテン酸カルシウム及び 2 Omgの硫酸鉄アンモニゥム （6水 和称） を加えた培地で培養した。
    [0027] 培養後、 集めた菌体を粉碎後、 スカーレツ ト MX— G—セファ ロ —スクロマ トグラフィ ー （スカーレッ ト MX— Gは、 商品名プ口シ オン · スカーレツ ト MX— Gと して I C Iジャパンよ り購入） に吸 着させ、 GlcKを PH上昇で、 又 G 6 P DHを N AD P添加でそれ ぞれ溶出させ、 次いで硫安分画した。 さらに两酵素をセフアクリル S— 200クロマトグラフィ一でゲル濾過に供し、 精製酵素を得た。 上記の如く精製した GlcKと G 6 PDHを用いてマグネシウムィ ォン測定用試薬を調製した。 GlcK 1 ュニッ 卜 Zral、 G 6 P D H 0. 7 5ュニッ ト Zm A TP [ベーリ ンガー . マンハイム山之內（株） より購入] 2.5mM、 NAD P [ベー リ ンガー ' マンハイ ム山之内 (株）より購入] 0.6 2 5mM、 G E D T A 0 · 5mM、 塩化力リ ウ厶 1 8.75 mM 1 2 5mMイ ミダゾ一ル—塩酸緩衝液 （PH 8 . 0 ) よりなる試薬を調製した （実施例 1 ) 。 また別に 5 OmMダルコ一 ス溶液を調製した。
    [0028] 比較と して、 バチルス . ステア口サ一モフ ィルス （Bacillus st earothennophilus)由来 GlcK [生化学工業（株）より購入] とロイ コノ ス ト ック ' メセン "ロイテス (_L euconostoc mesenteroidesリ 由来 G 6 P D H [ベーリ ンガー · マンハイム山之内（株）より購入] を用いて、 以下の組成のマグネシウム測定用試薬を調製した （比較 例 1 ) (特開平 1 — 5 1 1 0 0号公報参照） 。 GlcK 0.4 4ュニッ ト /ml、 G 6 PDH 0.75ュニッ ト ^1、 AT P 1 2.5mM, N AD P 0.6 2 5 mM、 G E D T A 0.5mM、 K C 11 8.7 5mM、 1 2 5mMト リ ス—塩酸緩衝液 （PH 8.5 ) よりなる試薬を調製し た。
    [0029] 次に試料として、 塩化マグネシウムを用いてマグネシウムを 0 , 4-, 8， 1 2， 1 6 , 2 0 , 2 4 , 2 8， 3 2 , 3 6， 4 0 mg/dl の各濃度を含む溶液を調製した。
    [0030] 上記で調製した測定用試薬 2.4mlを光路長 1 cmのセルに入れ、 上記で調製した試料 0.0 3 mlを添加し、 セル室を 3 7°Cの恒温に 保った後、 グルコース溶液 0.6mlを添加して反応を開始し、 3 4 Onmの吸光度変化を測定し、 1分間当りの吸光度変化量から試料中 のマグネシウム量を定量し、 その結果を図 1に示した。
    [0031] 実施例 1ではマグネシゥム約 3 Omg/dlまで直線的に 1分間当り の吸光度変化量が増加し、 一方、 比較例 1ではマグネシウム約 1 0 mg/dlまでしか 1分間当りの吸光度変化量は直線的に増加しなかつ た。 このことから、 本発明の測定用試薬は広い測定の範囲を示すこ とが明らかとなった。
    [0032] 実施例 2
    [0033] 実施例 1で調製した GlcKとロイコノス トック · メセンテロイデ ス (Leuconostoc tnesenteroides) 由来の G 6 P DH [ベー リ ンガ 一 · マンハイ ム山之内（株）より購入] を用いて、 マグネシウムィォ ン測定用試薬を調製した。 GlcK 1ュニッ 卜/ ml、 G 6 P DH 0. 7 5ュニッ ト/ "ml、 AT P 2.5mM、 N A D P 0.6 2 5mM、 B A P T A 0.6 2 5mM、 塩化力リウム 1 8.7 5mM、 1 2 5 mMイ ミ ダゾール—塩酸緩衝液 （pH 8.0) よりなる試薬を調製した （実施 例 2) 。 実施例 1 と同じ手法で各種澳度のマグネシウム含有溶液を 測定し、 1分間当りの吸光度変化量のマグネシゥム量依存性を調べ た。 その結果、 1分間当りの吸光度変化量はマグネシウム濃度約 3 Omg/dlまで直線関係にあることが判り、 本発明の測定用試薬は広 い測定範囲を有することが示された。
    [0034] 実施例 3
    [0035] 実施例 1 と同様の試薬を調製した。 マグネシウムを約 0.6mg/dl を含む血清を試料と して用い、 同じ試料を 3 0回測定して、 測定の 正確性を調べた。 その結果、 測定平均値は 0.6 1 m/d 標準偏差 は 0.0 1 mg/dlとなり、 測定の正確性を表す変動係数は 1 .6 4 % と極めて正確な試薬であることが示された。 このように、 本発明の 測定用試薬は広い測定範囲をもち、 かつ、 マグネシウムイオンの低 濃度領域でも正確に測定できる試薬であることが判った。
    [0036] 実施例 4
    [0037] 実施例 2と同様の試薬を調製し、 冷蔵庫中で約 1力月にわたり試 薬を保存し、 1 0日毎に経時的に 3種の試料を用いて試料中のマグ ネシゥムを測定した。 その結果を表 1に示した。
    [0038] 表 1 保存による測定の範囲の変化 このように本発明の測定用試薬は、 長期にわたり測定の範囲が保 たれている安定な試薬であることが判った。
    [0039] 実施例 5
    [0040] 実施例 1で調製した GlcKと G 6 PDHを用いて、 マグネシウム イオン測定用試薬を調製した。 GlcK 1 .0u/ml、 G 6 PDH 0.7 5u/mK グルコース 1 2.5mM、 N A D P 0.6 2 5mM、 G E D T A 0.5mM、 K C 1 1 8.7 5 mM、 N—ァセチルシスティ ン 1 2. 5mM、 1 0 OmMビシン （B icine) 緩衝液 （pH 7.8 ) よりなる 試薬を調製した。 別に、 ATP 1 6mM、 硫酸アンモニゥム 8 0 mM、 2 OmMビシン （B icine) 緩衝液 （pH 7.8 ) よりなる試薬を調製 した。
    [0041] 次に、 実施例 1 と同様にして、 塩化マグネシウムを用いてマグネ シゥムを 0 , 4 , 8， 1 2 , 1 6 , 2 0， 2 4， 2 8 , 3 2， 3 6 , 4 Omg/dlの各濃度を含む試料溶液を調製した。
    [0042] 上記で調製した測定用試薬 2.4 mlを光路長 1 cmのセルに入れ、 上記で調製した試料 0.0 3mlを添加し、 セル室を 3 7°Cの恒温に 保った後、 ATPを含む測定用試薬 0.6mlを添加して反応を開始 した。 3 4 Ontnの 1分間当りの吸光度変化は試料中のマグネシゥム 量約 3 2 mg/dlまで直線的に増加することが判り、 本発明の測定用 試薬は広い測定の範囲を示すことが明らかとなった。
    [0043] 実施例 6 実施例 1で調製した G lcKと Leuconostoc mesenteroides由来 G 6 PDHを用いてマグネシウムィオン測定用試薬を調製した。 Glc K.l u/mK G 6 P D H 1.5 u/mU グルコース 1 2.5 mM、 NAD P 4 mM、 GEDTA 0.5 mM、 K C 1 1 8.75 mM、 N—ァセチ ルシスティ ン i 2.5 mM、 1 0 OraMビシン （ B icine) 緩衝液 （p H 7.8) よりなる試薬を調製した。 別に ATP 1 6mM、 硫酸アン モニゥム 80ιηΜ、 2 ΟπιΜビシン （B icine) 緩衝液 （pH 7.8) よりなる試薬を調製した。 これら 2種の試薬を冷蔵庫中で約 1力月 にわたり保存し、 1 0日毎に経時的に 3種のマグネシウムを含む試 料を用いて試料中のマグネシゥムイオンを測定した。 その結果を表 2に示した。
    [0044] 表 2 保存による測定の範囲の変化 このように本癸明の測定用試薬は、 長期にわたり測定の範囲が保 たれている安定な試薬であることが判った。
    [0045] 実施例 7
    [0046] 実施例 1で調製した G lcKと Leuconostoc mesenteroides由来 G 6 PDHを用いてマグネシウムィオン測定用試薬を調製した。 Glc K 1 u/mU G 6 PDH 1 .5 /m グルコース 1 2.5mM、 NAD P 4mM、 GE DTA 0.5mM、 K C 11 8.7 5mM、 硫酸アンモニ ゥム 2 0 mM、 N—ァセチルシスティ ン 1 2.5 mM、 1 0 0 mMビシ ン （B icine) 緩衝液 （pH 7.8) よりなる試薬を調製した。 別に、 A T P 1 6 mM、 2 0 mMビシン （ B icine) 緩衝液 （pH 7.8 ) よ りなる試薬を調製した。
    [0047] 次に試料と して、 0.5tng/dl、 1 Omg/dl、 及び 3 Omg/dlのマグ ネシゥムを含む溶液を調製し、 同じ試料を各々 3 0回測定して測定 の正確性を調べた。 その結果、 測定平均値は各々 0.5 1 mg/dl、 1 0.1 mg/dU 及び 2 9.9mg/dlとなり、 標準偏差は各々 0.0 1 mg/ dl、 0.1 5mg/dl、 及び 0.3 Omg/dlとなり、 測定の正確性を表す 変動係数は各々 1 .9 6 %、 1 .4 9 %、 及び 1 .0 0 %と極めて正 確な試薬であることが示された。 このように、 本発明の測定用試薬 は広い測定範囲をもち、 かつ、 マグネシウムイオンの低濃度領域で も正確に測定できる試薬であることが判った。
    [0048] (図面の簡単な説明）
    [0049] 第 1図は、 本発明のマグネシウムイオン測定用試薬の測定範囲を 示すものであり、 縦軸にはサンブル中のマグネシウムィオン量測定 値 （mg/dl) を、 横軸にはサンプルの希釈系列を示している。 秦印 が実施例 1の測定結果を示し、 〇印が比較例 1の測定結果を示す。
    权利要求:
    Claims請求の範囲
    1 . マグネシウムイ オンをアデノ シン 5 '—三リ ン酸と錯体を形 成させ、 この錯体を酵素反応の基質と して利用して定量するマグネ シゥムイオン測定用試薬において、 ザィモモナス属細菌由来のグル コキナーゼを用いることを特徴とするマグネシウムイオン測定用試
    2 . ダルコキナーゼがザィモモナス ' モビリ ス （ Z yraomonas mob i l l s) 由来のダルコキナーゼであることを特徴とする第 1項記載の マグネシウムィオン測定用試薬。
    3 . ザィモモナス属細菌由来のダルコキナーゼ 0 . 1 〜 5 0ュニッ ト Zm l、 グルコース— 6 —リ ン酸脱水素酵素 0 . 1 〜 5 0ュニッ ト m U アデノ シン 5 '—三リ ン酸 0 . 0 1 〜 2 0 mM、 ニコチンアミ ドアデニンジヌク レオチ ドリ ン酸 0 . 1 〜 2 0 mM、 グルコース 1 ~ 1 0 O mMを含有する第 1項記載のマグネシゥムィ オン測定用試薬。
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    EP0536408A1|1993-04-14|
    DE69221695D1|1997-09-25|
    DE69221695T2|1998-02-26|
    引用文献:
    公开号 | 申请日 | 公开日 | 申请人 | 专利标题
    法律状态:
    1992-10-01| AK| Designated states|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): JP US |
    1992-10-01| AL| Designated countries for regional patents|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): AT BE CH DE DK ES FR GB GR IT LU MC NL SE |
    1992-12-11| WWE| Wipo information: entry into national phase|Ref document number: 1992906363 Country of ref document: EP |
    1993-04-14| WWP| Wipo information: published in national office|Ref document number: 1992906363 Country of ref document: EP |
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    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
    JP7572091||1991-03-14||
    JP3/75720||1991-03-14||DE1992621695| DE69221695T2|1991-03-14|1992-03-09|Mittel zur bestimmung von magnesiumionen|
    US07/960,364| US5683889A|1991-03-14|1992-03-09|Reagent for measurement of magnesium ion|
    EP19920906363| EP0536408B1|1991-03-14|1992-03-09|Reagent for assaying magnesium ions|
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